secuenciación de ADN

Estructura y secuencia del ADN

El ADN tiene una estructura de doble hélice compuesta por bloques de construcción que llamamos nucleótidos (o bases). El ADN se compone de cuatro bloques de nucleótidos. Estas bases se dividen en dos categorías: las bases purínicas, que son la Guanina (G) y la Adenina (A), y las bases pirimidínicas, que son la Citosina (C) y la Timina (T). Una cadena de ADN estaría compuesta por A, G, C y T, repitiéndose en un orden aparentemente aleatorio (Fig. 1).

Al principio, el orden de estas cuatro bases puede parecer aleatorio, pero no lo es en absoluto. La disposición de estas cuatro bases es muy importante y corresponde a información genética diferente dentro de una célula o un organismo. Estas bases proporcionan la base genética subyacente de los distintos rasgos de un individuo. (también conocido como su fenotipo)

Cualquier cambio en esta secuencia de ADN se denomina mutación. Puedes pensar en la mutación como un "error" en la secuencia de ADN que puede surgir cuando el ADN se copia durante la replicación del ADN o como resultado de distintos factores ambientales, como el tabaquismo, la exposición a la luz solar, la radiación y otros mutágenos.

La mutación en el ADN puede dar lugar a la diversidad de las especies, ya que produce nuevos alelos (variantes de genes). Las mutaciones pueden ser perjudiciales, beneficiosas o neutras. Las mutaciones perjudiciales afectan negativamente a la aptitud evolutiva de un organismoo a su capacidad para sobrevivir y reproducirse. Por elcontrario , las mutacionesbeneficiosas influyen positivamente en la aptitud evolutiva de un organismo. La mayoría de las m utaciones sonneutras: no tienen ningún efecto sobre la aptitud evolutiva de un organismo. Aunque la mayoría de las mutaciones son neutras, las mutaciones más graves pueden dar lugar a diversos trastornos genéticos letales. Una de las enfermedades genéticas humanas más comunes es el cáncer causado por mutaciones perjudiciales, que provocan el crecimiento incontrolado de las células.

Emparejamiento de bases complementarias en una secuencia de ADN

Las cuatro bases nitrogenadas se emparejan y se unen mediante enlaces de hidrógeno. La adenina (A) siempre se empareja con la timina (T), unidas por dos enlaces de hidrógeno, mientras que lacitosina (C) siempre se empareja con la guanina (G), unidas por tres enlaces de hidrógeno. Esto se denomina emparejamiento de bases complementarias. El emparejamiento de bases complementarias desempeña un papel importante en la secuenciación del ADN.

Expresión y regulación génicas

La expresióngénica es el proceso de convertir las instrucciones de nuestro ADN en ARN y proteínas. Tienelugar en dos etapas principales: la transcripción, en la que se produce una copia de la secuencia de ADN de un gen y se escribe en ARN, y la traducción, en la que sesintetiza la proteína utilizando la información genética contenida en la plantilla de ARN mensajero (ARNm). Examinemos cómo se transforma una secuencia de ADN durante estas dos etapas de la expresión génica.

Transcripción: de secuencia de ADN a ARNm

Durante la transcripción del ADN, la cadena de ADN sirve de molde para el ARNm. La enzima ARN polimerasa forma un ARNm recorriendola cadena de ADN desde el extremo 3′ → 5'. A medida que recorre la cadena, "copia" la secuencia de bases añadiendo pares de bases complementarias desde el extremo 5′ → 3′. Recuerda que el ARN tiene uracilo (U) en lugar de timina (T), pero conserva la adenina (A), la guanina (G) y la citosina (C). Una guanina (G) en el ADN indicaría la adición de una citosina (C) en la cadena de ARNm en crecimiento. Del mismo modo, una timina (T) en el ADN se copiará en una adenina (A) en el ARNm. La información de la secuencia de ADN pasará a este ARNm. A continuación, el ARNm se someterá a traducción para producir una proteína.

Traducción: de la secuencia de ARNm a la proteína

El ARNm pasa del núcleo (en eucariotas) o del citoplasma (en procariotas) a los ribosomas, donde se traducirá en proteínas. El orden de las bases del ARNm correspondería a aminoácidos específicos, que son los componentes básicos de las proteínas.

Secuenciación del ADN: gráfico que muestra cómo se traducen las secuencias de ARNm en aminoácidos

Como ya se ha mencionado, el ADN contiene la información genética necesaria para producir proteínas. La secuencia de ADN transcrita en ARNm se utilizará para formar cadenas de aminoácidos, que constituyen las proteínas. Cada tres bases de un ARNm corresponderían a un codón, y cada codón especifica un aminoácido (Fig. 2).

¿Cómo funciona la secuenciación del ADN?

La secuenciación del ADN requiere dividir la secuencia de ADN en trozos más pequeños o fragmentos. Se determina el orden de las bases de estos pequeños fragmentos y luego se ensamblan para formar el fragmento original.

Una de las técnicas más populares para la secuenciación del ADN es el método de secuenciación de Sanger o método de terminación en cadena. Se considera un método de secuenciación de "primera generación". En la secuenciación de Sanger, la secuencia de ADN de interés se amplifica como la de una reacción en cadena de la polimerasa, pero modificada de tal manera que ahora es una reacción en cadena de la polimerasa de terminación en cadena.

La reacción en cadena de la polimerasa con terminación en cadena sigue una reacción en cadena de la polimerasa convencional, salvo que contiene un dideoxi adicional modificado o nucleótidos de terminación en cadena llamados desoxirribonucleótidos (ddNTPs) que también están marcados de forma fluorescente única.

Secuenciación del ADN: Método Sanger

En primer lugar, se desnaturalizaría el ADN bicatenario mediante calentamiento. Una vez enfriado, se uniría un cebador a la plantilla de ADN monocatenario. Al elevar de nuevo la temperatura, comenzará el paso de extensión: una ADN polimerasa añade nucleótidos para sintetizar nuevo ADN hasta que añade un ddNTP de la mezcla, que termina toda la reacción.

Este ciclo se repetirá varias veces, asegurándose de que prácticamente se añade un ddNTP en cada posición de la secuencia de ADN. Esto dará lugar a múltiples fragmentos de ADN de longitudes variables. Como el extremo de los fragmentos está marcado con fluorescencia, esto indicará el nucleótido final que se añadió. La mezcla de fragmentos se hará pasar por electroforesis en gel capilar, que separa los fragmentos por tamaño.

Un detector podrá detectar las señales fluorescentes dando lugar a un cromatograma. Un cromatograma suele mostrar los resultados de la secuenciación del ADN, donde las cuatro bases están representadas por colores específicos (Fig. 3). Un cromatograma suele contener entre 1000 y 1200 bases.

Ahora se puede determinar la secuencia del ADN a través de dicho cromatograma leyendo las bases de izquierda a derecha. Este orden equivale a la secuencia de bases del extremo 5' al 3' de la cadena de ADN. Aunque la secuenciación Sanger es eficaz en la secuenciación de pequeños fragmentos de ADN, incluso de hasta 900 pares de bases, la secuenciación de fragmentos mayores sería muy ineficiente mediante esta técnica. Para la secuenciación a gran escala, como la secuenciación del genoma de un organismo, se utilizan tecnologías recientes de secuenciación del ADN denominadas secuenciación de nueva generación .

Secuenciación del ADN: Secuenciación de Próxima Generación (NGS)

Las mejoras en la secuenciación del ADN condujeron al desarrollo de la más reciente secuenciación de segunda generación o de próxima generación (NGS). El principio de la NGS es similar al de la secuenciación Sanger. La NGS implica tres pasos generales

1. Preparación de la biblioteca

2. Amplificación del ADN

3. Secuenciación del ADN

Preparación de la biblioteca

Durante la preparación de la biblioteca, el ADN de partida se corta en fragmentos aleatorios por medios mecánicos o enzimáticos.

• Las secuencias de ADN pueden cortarse mecánicamente mediante un proceso llamado sonicación, en el que se utiliza energía sonora para agitar las partículas de una muestra.
• Las secuencias de ADN pueden cortarse enzimáticamente utilizando enzimas de restricción (ER). Tras reconocer los sitios específicos de la secuencia, las ER cortan el ADN produciendo un extremo romo o pegajoso con una secuencia conocida en cada extremo.

Una vez producida una biblioteca de diferentes tamaños de fragmentos de ADN, se amplificará mediante una reacción en cadena de la polimerasa.

Amplificación del ADN

Una vez preparada una biblioteca adecuada, es necesario amplificar el ADN para que un secuenciador detecte la señal. Durante la amplificación, un cebador se unirá a la plantilla monocatenaria mediante el emparejamiento de bases complementarias. Este cebador será el punto de partida para que una Taq polimerasa añada bases y forme nuevas cadenas de ADN.

Gracias al emparejamiento de bases complementariasdel ADN, los investigadores pueden predecir la secuencia del ADN complementario una vez conocida la secuencia de una cadena de ADN. Este emparejamiento de bases complementarias es la base de la polimerasa Taq para sintetizar nuevas cadenas de ADN.

Secuenciación del ADN

La secuenciación se realiza mediante diversos métodos de NGS (entre ellos Illumina, pirosecuenciación y secuenciación por ligadura). Para ello se carga la biblioteca en la plataforma de secuenciación, que lee las bases y produce datos que serán analizados por un software especializado.

Ejemplo de secuenciación del ADN: El Proyecto Genoma Humano

Antes, secuenciar un genoma entero sería impensable. Los científicos no disponían entonces de las herramientas y técnicas necesarias para analizar grandes fragmentos de ADN.

Hoy, con la llegada de las nuevas tecnologías, los científicos son capaces de secuenciar genomas enteros de distintos organismos, como demuestra el Proyecto del Genoma Humano, que duró de 1990 a 2003. El Proyecto Genoma Humano fue una colaboración entre un equipo de científicos internacionales cuyo objetivo era secuenciar completamente todo el genoma humano y cartografiar la ubicación de genes importantes en nuestros cromosomas.

Consiguieron no sólo determinar los pares de bases del ADN, sino también cartografiar todos los genes y anotar algunas de sus funciones. Este esfuerzo ha conducido a descubrimientos muy importantes sobre la estructura, organización y función del genoma humano.

Un beneficio no intencionado del proyecto fue el desarrollo de métodos más rápidos y baratos de secuenciación del ADN. En 2001, secuenciar 1 millón de bases costaba más de 5.000 $. Esto se ha reducido a 0,02 $ en 2016. Además, mientras que la secuenciación del primer genoma humano llevó más de 10 años, la secuenciación de un genoma humano en la actualidad sólo llevaría un par de días.