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Amplificación del ADN
Los procedimientos in vitro ("en vidrio" en latín) reproducen de manera artificial —en laboratorios y bajo condiciones controladas— procesos biológicos que se dan de forma natural in vivo ("dentro de lo vivo" en latín); es decir, dentro de los organismos vivos
La amplificación del ADN es una técnica de clonación molecular in vitro, que consiste en la producción de un gran número de copias de uno o varios fragmentos de ADN. También, es un proceso análogo a la replicación del ADN que ocurre previo a la división celular en los seres vivos.
Durante el proceso natural de replicación del ADN, una enzima llamada ADN polimerasa es la encargada de realizar la síntesis del ADN. Una vez que la doble hélice del ADN se ha abierto, se forma una horquilla de replicación. Luego, la ADN polimerasa toma uno por uno los nucleótidos sintetizados por en el núcleo de la célula, que complementan a los de cada cadena del ADN, y los incorpora para replicar o formar una nueva cadena de ADN.
Para entender detalladamente este proceso, visita nuestro artículo Replicación de ADN.
Proceso de PCR
La reacción en cadena de la polimerasa —o PCR, por sus siglas en inglés— se basa en el mecanismo natural de la enzima ADN polimerasa para amplificar (replicar) el ADN; hace uso de ciclos de temperaturas altas y bajas.
- A altas temperaturas, los enlaces de hidrógeno que unen a las dos cadenas de ADN y le dan su forma de doble hélice se rompen.
- Entonces, las hebras se separan y cada una puede funcionar como una cadena de ADN molde, donde laTaq polimerasa se une a cada una de estas —en puntos específicos determinados por cebadores o primers—.
- Luego, de la misma manera en que lo hace la ADN polimerasa, laTaq polimerasa comienza a adicionar los nucleótidos o dNTPs complementarios en la cadena molde; esta vez producidos sintéticamente, lo que forma la cadena complementaria.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método estándar y un proceso automatizado utilizado para amplificar fragmentos de ADN de interés.
Fig. 1: Proceso de amplificación de ADN por medio de PCR. La Taq polimerasa forma la cadena complementaria a la cadena de ADN molde, adicionando los dNTPs en la región flanqueada por los cebadores. Fuente: StudySmarter Originals.
Tener disponible una cantidad considerable de copias de un fragmento de ADN, para aprovecharlo en una gran variedad de aplicaciones, fue durante años una limitante para la biología molecular. Esto cambió en 1985, cuando el bioquímico americano Kary Banks Mullis desarrolló un método conocido como Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (por las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction), por el cual se le otorgó el premio Nobel de Química en 1993.
En la actualidad, la amplificación por PCR es un método ampliamente utilizado en muchas áreas de la ciencia, ya que permite la producción de millones y miles de millones de copias, no solo de fragmentos de ADN, sino de, básicamente, cualquier porción del genoma, incluido el ARN.
Aunque, para realizar la amplificación de ARN, el procedimiento tiene unas ligeras variaciones que mencionaremos más adelante.
Exploremos cada uno de los sustratos y condiciones necesarias para realizar una PCR:
ADN
Como mencionamos anteriormente, el ADN de interés puede ser un fragmento o un gen completo; pero, también, la secuencia de interés puede ser ARN. Sin embargo, como la Taq polimerasa solo puede usar el ADN como molde, cuando se amplifica una secuencia de ARN se utiliza previamente otra enzima denominada transcriptasa inversa o retrotranscriptasa; esta transcribe el ARN en ADN, para así poder realizar la amplificación.
Recuerda que tanto el ADN como el ARN son biomoléculas, denominadas ácidos nucleicos, las cuales están constituidas por nucleótidos que almacenan la información genética de los seres vivos. Las estructuras de ambos ácidos nucleicos se basa en casi las mismas unidades o nucleótidos: Adenina (A), Citocina (C), Guanina (G) y Timina (T), en el caso del ADN; o Uracilo (U), en el caso del ARN.
Podrás encontrar más información al respecto en nuestros artículos Estructura de los ácidos nucleicos y ADN y ARN.
Taq polimerasa
Inicialmente, para replicar los fragmentos de ADN se usaba una ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli; sin embargo, esta polimerasa se desnaturaliza (desconfigura) a altas temperaturas, por lo que se tenía que adicionar nueva polimerasa en cada ciclo de la PCR. Luego, se comenzó a implementar laTaq polimerasa, una enzima termoestable, que no se altera fácilmente por la acción del calor. Esta enzima se obtiene de la bacteria Thermus aquaticus (T-aq), que vive en aguas termales. A diferencia de las ADN polimerasas de los humanos y de E. coli, laTaq polimerasa alcanza su mayor actividad por encima de los 70°C.
Nucleótidos
Los nucleótidos de ADN libres o dNTPs (desoxirribonucleótidos trifosfatos) son los componentes básicos para la síntesis de nuevas cadenas de ADN.
Para la amplificación de ADN por PCR se necesita incorporar una mezcla que contiene los 4 nucleótidos que hacen parte de la estructura del ADN: Adenina (A), Citocina (C), Guanina (G) y Timina (T). En esta mezcla, los dNTPs están en proporciones equimolares, lo que significa que hay un número igual de moléculas de cada uno.
Cebadores o primers
Los cebadores —o primers— son secuencias cortas, de alrededor de 20 nucleótidos, complementarias a los primeros nucleótidos del segmento de ADN que va a ser amplificado; son específicos para la secuencia de ADN de interés.
Estas secuencias cortas predefinidas de ADN sintético u oligonucleótidos se incorporan a las dos cadenas de ADN molde, específicamente al punto de inicio del fragmento de interés. Esto permite el acoplamiento de laTaq polimerasa y mantiene las dos cadenas separadas durante el proceso de amplificación.
Termociclador
Un termociclador es un instrumento que genera ciclos de altas y bajas temperaturas. Así, se aumenta y disminuye automáticamente la temperatura de las muestras, en un recipiente cerrado, según un programa automático preestablecido.
Ahora veamos cómo se desarrollan los ciclos de temperatura durante la PCR.
Ciclos de la PCR
El proceso de la PCR implica tres pasos que se repiten en muchos ciclos consecutivos (ver Fig. 3). Estos pasos son:
Desnaturalización: El termociclador aumenta la temperatura a más de 94°C. A esta temperatura, se rompen los enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarias que mantienen unidas las dos cadenas de ADN. Esto hace que las dos hebras de los fragmentos de ADN se separen.
Alineamiento o hibridación: El termociclador enfría la temperatura hasta poco más de 55°C. Los cebadores o primers pueden unirse a su secuencia de bases complementarias al principio de las hebras de ADN, mediante enlaces de hidrógeno. Los cebadores permiten a laTaq polimerasa anclarse a los sitios de inicio y fin de los fragmentos de ADN de interés y, por lo tanto, proporcionan el sitio de partida para la síntesis de ADN. Los cebadores o primers también impiden que las dos hebras se vuelvan a unir al bajar la temperatura, al ocupar ellos ese lugar.
Extensión o polimerización: La temperatura se aumenta, nuevamente, a 72°C. Esta es la temperatura óptima para que laTaq polimerasa funcione y añada los nucleótidos o dNTPS complementarios entre los cebadores o primers.
Fig. 3: El proceso de PCR se realiza en ciclos, en cada ciclo ocurren los 3 pasos: (1) desnaturalización, (2) hibridación y (3) extensión.
El diagrama muestra 2 ciclos del proceso.
Al final de cada ciclo, el número de fragmentos de ADN se duplica.
Por ejemplo, al final del primer ciclo, habría dos copias del fragmento original; y al final del segundo ciclo, el número de copias sería de cuatro.
El proceso se repite en muchos ciclos, para amplificar el número de copias del fragmento de ADN hasta la cantidad deseada. Esta cantidad puede depender del tipo de aplicación para la que se utilizarán los fragmentos de ADN; normalmente varía de 30 a 40 ciclos.
La fórmula utilizada para calcular el número de moléculas de ADN obtenidas después de varios ciclos de PCR es:
Número de moléculas de ADN = 2n
- Donde, n es el número de ciclos.
Esto significa que la cantidad de copias del ADN de interés que produce la PCR aumenta de forma exponencial con cada ciclo.
Ventajas y desventajas de la PCR
Aunque la PCR presenta algunas desventajas, ciertamente son más las ventajas que tiene la implementación de esta técnica en sus diversas aplicaciones. Revisemos cuáles son estas ventajas y desventajas:
Ventajas
Es muy rápida y tiene un alto rendimiento: puede utilizarse para producir millones de copias de ADN en pocas horas.
Esta técnica es especialmente útil cuando se tiene poca cantidad del ADN de interés; como al obtener muestras de ADN de fósiles donde, incluso, puede estar un poco degradado.
La PCR solo replica el ADN de interés (el gen diana), gracias al uso de cebadores. Por lo tanto, no es necesario que el fragmento de ADN de interés sea aislado de todo el ADN del huésped u otros contaminantes.
No requiere ningún sistema vivo, como un hospedero para replicar el ADN (por ejemplo). Esto reduce los costos, tiempo y conocimientos técnicos necesarios para utilizar la PCR en relación con el proceso in vivo.
Puede utilizarse para crear moléculas de ADN de doble cadena, a partir de cadenas de ADN simples. Esto es especialmente útil cuando se crean fragmentos de ADN, a partir de ARN, utilizando la enzima transcriptasa inversa.
Desventajas
No puede producir ARNm o proteínas de forma directa.
Funciona mejor con fragmentos de ADN de corta longitud (pequeños).
Como un proceso automatizado artificial, no cuenta con procesos de corrección de errores; como sí los tienen los sistemas in vivo —al usar el sistema de replicación de ADN de una bacteria para clonar ADN, esta incorpora su sistema de corrección de errores—. Por lo tanto, aunque pueden producirse millones de copias, no todas son secuencias correctas.
Aplicaciones de la PCR
Algunas de las principales aplicaciones de la PCR incluyen la amplificación de material genético para detectar patógenos como virus y bacterias, pruebas forenses y de paternidad, investigación biomédica y muchas más. Veamos algunas de ellas:
- Pruebas Covid-19 y de otros virus: Mediante la amplificación de su material genético, la PCR permite detectar en poco tiempo la presencia del SARS-CoV-2 —virus de la familia de los coronavirus, responsable del Covid-19— en una muestra (hisopado, en este caso),
- Pruebas forenses: A partir de muestras biológicas (fluidos corporales, sangre, tejidos, etc.) se pueden extraer células que tengan el ADN intacto para amplificar ciertos fragmentos con polimorfismos que permiten identificar a una persona.
- Pruebas de paternidad: Las pruebas de paternidad también se basan en la detección de polimorfismos, ya que entre más estrechamente emparentadas estén dos personas, mayor será el grado de similitud de su código genético.
Los polimorfismos son variaciones en la información genética; por ejemplo, en la posición y el orden de los nucleótidos dentro de una cadena de ADN que presentan los individuos de una misma especie.
Debido a la falta de corrección de errores en las moléculas de ADN creadas, la técnica de PCR se usa comúnmente para obtener suficientes fragmentos de ADN para utilizar posteriormente con alguna técnica in vivo de amplificación de ADN, y no para sustituir las técnicas in vivo. Sin embargo, como técnica para detectar secuencias de interés, como en los ejemplos mencionados arriba, es muy útil.
PCR - Puntos clave
- La Reacción en Cadena de la Polimerasa, o PCR, es una técnica in vitro para la amplificación del ADN o clonación, que es la producción de un gran número de copias de uno o varios fragmentos de ADN.
- Esta técnica permite la producción de millones y miles de millones de copias, no solo de fragmentos de ADN, sino de, básicamente, cualquier porción del genoma, incluido el ARN.
- La PCR se basa en el mecanismo natural de la enzima ADN polimerasa para amplificar (replicar) el ADN, mediante ciclos de temperaturas altas y bajas.
- Esta técnica requiere:
- ADN: La región de la información genética de interés.
- Taq polimerasa: La enzima termoestable encargada de la amplificación.
- dNTPs: Los nuleotidos de ADN con los que se van a formar las nuevas cadenas.
- Cebadores: cadena corta de nucleótidos que son específicos para unirse al ADN objetivo.
- Termociclador: Instrumento que genera ciclos de temperatura.
- La PCR ha sido ampliamente usada, desde mucho antes de la pandemia de Covid-19, en áreas como la investigación forense y las pruebas de paternidad, entre otras.
- La amplificación de ADN mediante la PCR es un proceso rápido, de alto rendimiento, exactitud y precisión. Puede usarse, incluso, para crear moléculas de ADN de doble cadena a partir de cadenas de ADN simples.
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Preguntas frecuentes sobre PCR
¿Qué es la PCR y cuáles son sus pasos?
La PCR, o reacción en cadena de la polimerasa, es un método estándar y un proceso automatizado utilizado para crear múltiples copias (amplificar) de fragmentos de ADN de interés.
Consta de 3 pasos: Desnaturalización, Alineamiento o hibridación y Extensión o polimerización.
¿Cuánto dura un ciclo de PCR?
Aunque el tiempo que se programa para cada paso de un ciclo de PCR varía en función de factores como la muestra de ADN y el objetivo de la amplificación, la desnaturalización puede tomar entre 15 y 30 segundos, el alineamiento o hibridación de 15 segundos a 1 minuto, y la extensión o polimerización entre 45 segundos y 2 minutos.
Entonces, el tiempo que toma un ciclo de la PCR puede ser desde un poco más de 1 minuto hasta más de 3 minutos, y el número de ciclos estándar suele ser de alrededor de 30.
¿Cómo se desarrolla la técnica de PCR?
La PCR se basa en el mecanismo natural de la ADN Polimerasa para amplificar (replicar) el ADN.
- A altas temperaturas, los enlaces de hidrógeno que unen a las dos cadenas de ADN, y le dan su forma de doble hélice, se rompen.
- Entonces, las hebras se separan para cumplir el rol de ADN molde y la Taq polimerasa se une a cada una de estas en puntos específicos determinados por los cebadores o primers.
- Luego, de la misma manera en que lo hace la ADN polimerasa, la Taq polimerasa comienza a adicionar los nucleótidos o dNTPS complementarios, esta vez producidos sintéticamente, formando la cadena complementaria.
- Estos componentes se mezclan y se exponen a ciclos automatizados de calentamiento y enfriamiento dentro de un termociclador.
¿Cómo multiplicar ADN?
El ADN se multiplica de manera natural durante el proceso de replicación del ADN: una enzima llamada ADN polimerasa es la encargada de realizar la síntesis del ADN.
- Una vez que las cadenas de la doble hélice del ADN se han abierto, se forma una horquilla de replicación.
- Luego, la ADN polimerasa toma uno por unos los nucleótidos sintetizados en el núcleo de la célula que complementan a los de cada uno de los hilos del ADN y los incorpora a una nueva cadena.
- Una forma artificial de hacerlo es mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa, o PCR, que reproduce este proceso usando una polimerasa sintética, oTaq polimerasa, nucleótidos sintéticos (o dNTPS) y unas secuencias sintéticas denominados cebadores.
- Todos estas sustancias se mezclan con el ADN de interés y se someten a ciclos de temperaturas altas y bajas dentro de un aparato llamado termociclador.
¿Qué es la Taq polimerasa y para qué sirve?
LaTaq polimerasa es una enzima termoestable, que no se altera fácilmente por la acción del calor. Se obtiene de la bacteria Thermus aquaticus (T-aq) que vive en aguas termales. A diferencia de las ADN polimerasas de los humanos y de E. coli, laTaq polimerasa alcanza su mayor actividad por encima de los 70°C. Debido a esta propiedad, laTaq polimerasa se usa en el proceso de Reacción en Cadena de la Polimerasa, o PCR, para clonar o crear muchas copias de un segmento de ADN.
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