PCR

Proceso de PCR

La reacción en cadena de la polimerasa —o PCR, por sus siglas en inglés— se basa en el mecanismo natural de la enzima ADN polimerasa para amplificar (replicar) el ADN; hace uso de ciclos de temperaturas altas y bajas.

• A altas temperaturas, los enlaces de hidrógeno que unen a las dos cadenas de ADN y le dan su forma de doble hélice se rompen.
• Entonces, las hebras se separan y cada una puede funcionar como una cadena de ADN molde, donde laTaq polimerasa se une a cada una de estas —en puntos específicos determinados por cebadores o primers—.
• Luego, de la misma manera en que lo hace la ADN polimerasa, laTaq polimerasa comienza a adicionar los nucleótidos o dNTPs complementarios en la cadena molde; esta vez producidos sintéticamente, lo que forma la cadena complementaria.

Fig. 1: Proceso de amplificación de ADN por medio de PCR. La Taq polimerasa forma la cadena complementaria a la cadena de ADN molde, adicionando los dNTPs en la región flanqueada por los cebadores. Fuente: StudySmarter Originals.

En la actualidad, la amplificación por PCR es un método ampliamente utilizado en muchas áreas de la ciencia, ya que permite la producción de millones y miles de millones de copias, no solo de fragmentos de ADN, sino de, básicamente, cualquier porción del genoma, incluido el ARN.

Exploremos cada uno de los sustratos y condiciones necesarias para realizar una PCR:

ADN

Como mencionamos anteriormente, el ADN de interés puede ser un fragmento o un gen completo; pero, también, la secuencia de interés puede ser ARN. Sin embargo, como la Taq polimerasa solo puede usar el ADN como molde, cuando se amplifica una secuencia de ARN se utiliza previamente otra enzima denominada transcriptasa inversa o retrotranscriptasa; esta transcribe el ARN en ADN, para así poder realizar la amplificación.

Taq polimerasa

Inicialmente, para replicar los fragmentos de ADN se usaba una ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli; sin embargo, esta polimerasa se desnaturaliza (desconfigura) a altas temperaturas, por lo que se tenía que adicionar nueva polimerasa en cada ciclo de la PCR. Luego, se comenzó a implementar laTaq polimerasa, una enzima termoestable, que no se altera fácilmente por la acción del calor. Esta enzima se obtiene de la bacteria Thermus aquaticus (T-aq), que vive en aguas termales. A diferencia de las ADN polimerasas de los humanos y de E. coli, laTaq polimerasa alcanza su mayor actividad por encima de los 70°C.

Nucleótidos

Para la amplificación de ADN por PCR se necesita incorporar una mezcla que contiene los 4 nucleótidos que hacen parte de la estructura del ADN: Adenina (A), Citocina (C), Guanina (G) y Timina (T). En esta mezcla, los dNTPs están en proporciones equimolares, lo que significa que hay un número igual de moléculas de cada uno.

Cebadores o primers

Estas secuencias cortas predefinidas de ADN sintético u oligonucleótidos se incorporan a las dos cadenas de ADN molde, específicamente al punto de inicio del fragmento de interés. Esto permite el acoplamiento de laTaq polimerasa y mantiene las dos cadenas separadas durante el proceso de amplificación.

Termociclador

Ahora veamos cómo se desarrollan los ciclos de temperatura durante la PCR.

Ciclos de la PCR

El proceso de la PCR implica tres pasos que se repiten en muchos ciclos consecutivos (ver Fig. 3). Estos pasos son:

1. Desnaturalización: El termociclador aumenta la temperatura a más de 94°C. A esta temperatura, se rompen los enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarias que mantienen unidas las dos cadenas de ADN. Esto hace que las dos hebras de los fragmentos de ADN se separen.

2. Alineamiento o hibridación: El termociclador enfría la temperatura hasta poco más de 55°C. Los cebadores o primers pueden unirse a su secuencia de bases complementarias al principio de las hebras de ADN, mediante enlaces de hidrógeno. Los cebadores permiten a laTaq polimerasa anclarse a los sitios de inicio y fin de los fragmentos de ADN de interés y, por lo tanto, proporcionan el sitio de partida para la síntesis de ADN. Los cebadores o primers también impiden que las dos hebras se vuelvan a unir al bajar la temperatura, al ocupar ellos ese lugar.

3. Extensión o polimerización: La temperatura se aumenta, nuevamente, a 72°C. Esta es la temperatura óptima para que laTaq polimerasa funcione y añada los nucleótidos o dNTPS complementarios entre los cebadores o primers.

Fig. 3: El proceso de PCR se realiza en ciclos, en cada ciclo ocurren los 3 pasos: (1) desnaturalización, (2) hibridación y (3) extensión.

El diagrama muestra 2 ciclos del proceso.

Al final de cada ciclo, el número de fragmentos de ADN se duplica.

El proceso se repite en muchos ciclos, para amplificar el número de copias del fragmento de ADN hasta la cantidad deseada. Esta cantidad puede depender del tipo de aplicación para la que se utilizarán los fragmentos de ADN; normalmente varía de 30 a 40 ciclos.

La fórmula utilizada para calcular el número de moléculas de ADN obtenidas después de varios ciclos de PCR es:

Número de moléculas de ADN = 2ⁿ

• Donde, n es el número de ciclos.

Esto significa que la cantidad de copias del ADN de interés que produce la PCR aumenta de forma exponencial con cada ciclo.

Ventajas y desventajas de la PCR

Aunque la PCR presenta algunas desventajas, ciertamente son más las ventajas que tiene la implementación de esta técnica en sus diversas aplicaciones. Revisemos cuáles son estas ventajas y desventajas:

Ventajas

• Es muy rápida y tiene un alto rendimiento: puede utilizarse para producir millones de copias de ADN en pocas horas.

• Esta técnica es especialmente útil cuando se tiene poca cantidad del ADN de interés; como al obtener muestras de ADN de fósiles donde, incluso, puede estar un poco degradado.

• La PCR solo replica el ADN de interés (el gen diana), gracias al uso de cebadores. Por lo tanto, no es necesario que el fragmento de ADN de interés sea aislado de todo el ADN del huésped u otros contaminantes.

• No requiere ningún sistema vivo, como un hospedero para replicar el ADN (por ejemplo). Esto reduce los costos, tiempo y conocimientos técnicos necesarios para utilizar la PCR en relación con el proceso in vivo.

• Puede utilizarse para crear moléculas de ADN de doble cadena, a partir de cadenas de ADN simples. Esto es especialmente útil cuando se crean fragmentos de ADN, a partir de ARN, utilizando la enzima transcriptasa inversa.

Desventajas

• No puede producir ARNm o proteínas de forma directa.

• Funciona mejor con fragmentos de ADN de corta longitud (pequeños).

• Como un proceso automatizado artificial, no cuenta con procesos de corrección de errores; como sí los tienen los sistemas in vivo —al usar el sistema de replicación de ADN de una bacteria para clonar ADN, esta incorpora su sistema de corrección de errores—. Por lo tanto, aunque pueden producirse millones de copias, no todas son secuencias correctas.

Aplicaciones de la PCR

Algunas de las principales aplicaciones de la PCR incluyen la amplificación de material genético para detectar patógenos como virus y bacterias, pruebas forenses y de paternidad, investigación biomédica y muchas más. Veamos algunas de ellas:

• Pruebas Covid-19 y de otros virus: Mediante la amplificación de su material genético, la PCR permite detectar en poco tiempo la presencia del SARS-CoV-2 —virus de la familia de los coronavirus, responsable del Covid-19— en una muestra (hisopado, en este caso),
• Pruebas forenses: A partir de muestras biológicas (fluidos corporales, sangre, tejidos, etc.) se pueden extraer células que tengan el ADN intacto para amplificar ciertos fragmentos con polimorfismos que permiten identificar a una persona.
• Pruebas de paternidad: Las pruebas de paternidad también se basan en la detección de polimorfismos, ya que entre más estrechamente emparentadas estén dos personas, mayor será el grado de similitud de su código genético.

Debido a la falta de corrección de errores en las moléculas de ADN creadas, la técnica de PCR se usa comúnmente para obtener suficientes fragmentos de ADN para utilizar posteriormente con alguna técnica in vivo de amplificación de ADN, y no para sustituir las técnicas in vivo. Sin embargo, como técnica para detectar secuencias de interés, como en los ejemplos mencionados arriba, es muy útil.