Cromatografía en columna

Principios de la cromatografía en columna

Todos los tipos de cromatografía siguen los mismos principios básicos.

1. Utilizamos un disolvente, denominadofase móvil , para disolver una muestra de una mezcla soluble. El disolvente transporta la mezcla a través de un sólido llamado fase estacionaria.
2. Algunos componentes de la mezcla son transportados por el disolvente a través del sólido más rápidamente que otros. Decimos que los componentes que viajan más rápido tienen una mayor afinidad a la fase móvil. Así se separa la mezcla en sus componentes.

Veamos ahora cómo se aplica a la cromatografía en columna.

Fase estacionaria

En la cromatografía en columna, la fase estacionaria está formada por un fino polvo de sílice empaquetado en una larga columna de vidrio. La columna está abierta por un extremo y tiene un grifo en el otro. Se coloca una capa de lana mineral en el fondo de la columna para evitar que el polvo de sílice sea arrastrado.

Fase móvil

En la cromatografía en columna, la fase móvil es cualquier disolvente adecuado. También se denomina eluyente. Disuelves tu mezcla de muestra en el disolvente y la viertes por la columna para que se desplace a través de la fase estacionaria.

Tiempos de retención

En otros tipos de cromatografía, como la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina, podemos calcular los factores de retención. Son medidas de la distancia que recorre cada componente de la mezcla a través de la fase estacionaria en comparación con la distancia total recorrida por el disolvente. Pero en la cromatografía en columna, en cambio, calculamos los tiempos de retención.

Afinidad relativa

Una sustancia con mayor afinidad por la fase móvil se desplaza más rápidamente a través del sólido de la columna que las que tienen mayor afinidad por la fase estacionaria. La afinidad relativa tiene que ver con la unión entre la sustancia y la fase estacionaria o la fase móvil.

Veamos la estructura de la fase estacionaria, el polvo de sílice. También se conoce como dióxido de silicio. Cada partícula de sílice tiene una capa de grupos -OH en el exterior, como se muestra a continuación:

Fig. 2 - Estructura de la sílice

Estos grupos -OH hacen que la sílice pueda formar enlaces de hidrógeno con sustancias adecuadas. Los enlaces de hidrógeno son un tipo de fuerza intermolecular. Estos enlaces mantienen la sustancia en su sitio y evitan que el disolvente la arrastre tan rápidamente por la columna. Por tanto, podemos predecir lo siguiente:

• Las sustancias que pueden formar enlaces de hidrógeno se unirán más fuertemente al polvo de sílice y, por tanto, tendrán mayor afinidad por la fase estacionaria y menor afinidad por la fase móvil. Se moverán más lentamente por la columna y darán tiempos de retención más altos. Decimos que están adsorbidas más.

• Las sustancias que no pueden formar enlaces de hidrógeno se unen con menos fuerza al polvo de sílice. Siguen existiendo otras fuerzas intermoleculares entre ellas y el polvo de sílice, pero son más débiles que los enlaces de hidrógeno , por lo que la sustancia se desplaza más rápidamente por la columna. La sustancia tiene mayor afinidad por la fase móvil y menor afinidad por la placa estacionaria. Tales sustancias son más solubles en el disolvente y dan tiempos de retención más rápidos.

Por ejemplo, los aminoácidos pueden formar enlaces de hidrógeno porque contienen un grupo N-H. Sin embargo, los alquenos no pueden. Sin embargo, los alquenos no pueden. Por tanto, los aminoácidos tienen una mayor afinidad con la fase estacionaria que los alquenos y, por tanto, tiempos de retención más elevados. El alqueno atravesará la columna más rápidamente que el aminoácido.

Método de cromatografía en columna

¿Cómo se realiza la cromatografía en columna? Implica los siguientes pasos.

1. Coloca una capa de lana mineral en el fondo de la columna y luego llena la columna con polvo de sílice; ésta es tu fase estacionaria.
2. Satura el polvo de sílice con disolvente; ésta es tu fase móvil.
3. Vierte la mezcla de la muestra en la parte superior de la columna.
4. Abre el grifo de la parte inferior de la columna mientras viertes continuamente disolvente en la parte superior de la columna. Deja que el disolvente transporte la muestra a través del polvo de sílice y recoge el efluente que sale por la parte inferior.

Éste es el aspecto que debe tener tu columna después de haber vertido la mezcla en la parte superior.

Fig. 3 - Configuración de la cromatografía en columna

La mezcla debe separarse en distintos componentes que se mueven por la columna a distintas velocidades. Asegúrate de cambiar el vaso de precipitados por uno nuevo cuando cada componente llegue al final de la columna.

Fig. 4 - Método de cromatografía en columna

Análisis de la cromatografía en columna

Observa el ejemplo anterior. La mezcla verde de la muestra se divide en dos componentes diferentes, uno azul y otro amarillo. Por tanto, sabemos que la mezcla está formada por dos sustancias diferentes. También podemos ver que el componente amarillo se desplaza más rápidamente por la columna que el componente azul. Esto significa que el componente amarillo tiene un tiempo de retención más corto y una mayor afinidad por la fase móvil que el componente azul. Decimos que el componente azul se adsorbe más que el componente amarillo: tiene mayor afinidad y se une más fuertemente a la fase estacionaria.

¿Y ahora qué?

Una vez que hayas recogido los componentes de la muestra en diferentes vasos de precipitados, puedes seguir analizándolos. Por ejemplo, puedes realizar una espectrometría de masas o una cromatografía en capa fina con uno de los componentes para averiguar su identidad. Podrías purificarlo eliminando el disolvente. Una forma de hacerlo es mediante destilación. O simplemente podrías llevar a cabo algunas reacciones básicas en tubos de ensayo para obtener algunas pistas sobre la estructura y la reactividad del componente.

Ventajas de la cromatografía en columna

Ahora que sabemos cómo funciona la cromatografía en columna, podemos considerar algunas de sus ventajas.

• Puedes analizar grandes cantidades de una muestra. Esto es útil para separar mezclas.
• La fase estacionaria suele ser barata y fácil de eliminar.
• Tiene una gran variedad de aplicaciones potenciales, dependiendo del disolvente utilizado.

Usos de la cromatografía en columna

La cromatografía en columna no es sólo una forma genial de dividir mezclas en franjas de distintos colores; al fin y al cabo, si quisiéramos hacer arco iris, ¡simplemente podríamos utilizar un prisma para dividir la luz! En realidad, la cromatografía en columna tiene una serie de aplicaciones en el mundo real. Entre ellas:

• Aislar principios activos, que hemos mencionado al principio del artículo.
• Separar mezclas, como una mezcla de aminoácidos.
• Aislar metabolitos de muestras biológicas.
• Eliminar impurezas.